Cinchonidine，一種主要的金雞納生物鹼，對硫酸??酚引發內皮損傷的細胞保護作用及其分子機制探討：p53訊息傳遞路徑在其中的關鍵性角色

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題名:	Cinchonidine，一種主要的金雞納生物鹼，對硫酸??酚引發內皮損傷的細胞保護作用及其分子機制探討：p53訊息傳遞路徑在其中的關鍵性角色 Study of the cytoprotective effects of cinchonidine, a major Cinchona alkaloid, on indoxyl sulfate-induced endothelial dysfunction: a critical role of p53 signaling pathway
作者:	鄧睿敦 Teng, RUEI-DUN
貢獻者:	醫學科學研究所博士班謝政穎楊志豪
關鍵詞:	心腎症候群;硫酸??酚;內皮細胞功能異常;辛可尼汀;p53;MDM2 cardiorenal syndrome;indoxyl sulfate;endothelial dysfunction;cinchonidine;p53;MDM2
日期:	2023-06-30
上傳時間:	2023-12-11 14:21:07 (UTC+8)
摘要:	慢性腎臟病主要會造成患者腎功能逐漸喪失，迫使許多代謝廢物無法排出體外，尤以尿毒素 (uremic toxins) 的堆積，所引發的尿毒症 (uremia)，不僅會加速慢性腎臟病的病程，同時還會促使心血管相關的併發症發生，而心血管疾病也是目前造成慢性腎臟病死亡的主因。其中硫酸??酚 (indoxyl sulfate; IS) 為主要造成血管內皮細胞損傷的尿毒素之一，且細胞內積存的 IS 會誘發大量的活性氧分子 (reactive oxygen species; ROS) 產生，促使氧化壓力上升，造成細胞損傷。目前臨床常使用的藥物 ─ 克裏美淨 (AST-120; kremezin) ，為具有吸附力之活性碳物質，可在腸道內吸附 IS 的前驅物 ─ ?? (indole)，並藉由糞便排出體外，進而降低??在肝臟中被代謝成 IS ，但目前臨床還尚未證實能有效改善或恢復慢性腎臟病，只能延緩慢性腎臟病及心血管相關併發症的進程，因此應開發新的治療方法來降低 IS 所引起的傷害。因此我們利用H2DCFDA 及 MTT 試驗來評估131種天然化合物在與人類臍靜脈內皮細胞 (HUVECs) 預處理後，是否可以清除由 IS 所誘導ROS 的產生，並增加細胞對 IS 的抗性，進而降低 IS 所造成細胞損傷。於此我們篩選出由金雞納樹 (Cinchona) 所萃取出來的金雞納生物鹼 (cinchona alkaloid) ─ cinchonidine，可有效地增加HUVECs的存活率，雖然 cinchonidine 在 ROS 的清除能力並不顯著，但卻能提升 HUVECs 抵抗 IS 誘發的細胞傷害，且cinchonidine 與結構相似的 quinine 、 quinidine 及 cinchonine 相比，不僅有著更優異的細胞保護能力，且藥物本身所引起的細胞毒性也較弱，另一面，藉由β-半乳糖??染色 (β-galactosidase staining) 及血管形成試驗 (tube-formation assay) 的進一步測試，也發現 cinchonidine 還可降低由 IS 所造成的內皮細胞老化現象 (senescence) ，並在IS的刺激下，維持內皮細胞所形成的管腔。雖然 cinchonidine 無法藉由抑制有機陰離子轉運蛋白3號 (organic anion transporter 3; OAT3) 的活性，來阻止HUVECs攝取 IS ，但在透過 RNA-Seq 對基因的表現變化做探測及後續 gene ontology 的軟體分析中發現，在 IS 的刺激下，給予 cinchonidine 可以促使與細胞週期控制有關的基因被上調，而流式細胞儀的結果也指出 cinchonidine 可以反轉由 IS 所造成的細胞週期停滯在 G0/G1 phase ，而在 GSEA 和 KEGG 軟體的進一步分析下，其結果暗示 p53 及 MDM2 可能參與其中，雖然在qRT-PCR的測定下， IS 的刺激並不會改變 p53 的 mRNA 表現量，但 p53 的蛋白質表現量卻有顯著性的增加，且在給予 HUVECs 預處理 cinchonidine 後，即便在 IS 的刺激下， p53 的蛋白質表現量則有顯著性的被抑制，透過 reporter assay 的測定，也發現 p53 轉錄因子的結合活性 (binding activity) 也一併跟著降低。同時已知活化後的MDM2會進入細胞核內，促使核內 p53 被泛素化 (ubiquitination) 後出核被蛋白?體 (proteasome) 所分解，所以我們利用細胞核、質分離技術，搭配西方墨點法的偵測下發現，在 IS 的單獨刺激下，細胞核內的MDM2會顯著性的減少，但 HUVECs 預處理 cinchonidine 後， MDM2 的入核比率顯著性的上升，與此同時，p53 在入核的比例也會隨之減少，證實 cinchonidine 可藉由促進 MDM2 入核，來促使p53 出核，並在細胞質中被分解，進一步抑制 p53 的活性及其相關訊息傳遞路徑的活化，從而降低由 IS 所引起的內皮細胞損傷。 Chronic kidney disease (CKD) usually induces multiple complications, especially renocardiac syndromes are a critical concern among CKD patients. A protein-bound uremic toxin called indoxyl sulfate (IS) is known to affect cardiovascular disease's pathogenesis by inducing endothelial dysfunction. Although a current drug-AST120 could remove indole, a precursor of IS, the therapeutic effects on renocardiac syndromes are still controversial. Thus, finding a novel therapeutic approach is an urgent priority for treating IS-associated endothelial dysfunction. Our recent study found that a natural compound called cinchonidine, a derivative from cinchona alkaloid, showed the most outstanding cell-protective effects among the 131 test compounds in IS-induced human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The results showed that cinchonidine treatment significantly reversed IS-induced senescence, impaired tube formation, and cell death in HUVEC cells. Although cinchonidine could not reduce intracellular IS-stimulated ROS formation or modulate OAT3 transporter activity to reduce cellular uptake of IS, the RNA-Seq analysis indicated that cinchonidine treatment downregulated p53-modulated gene expression and substantially decreased IS-caused G0/G1 cell cycle arrest. Despite there was no difference in p53 mRNA levels when treated with cinchonidine in IS-treated HUVECs. Cinchonidine treatment could still induce p53 degradation and promote cytoplasmic-nuclear shuttling of MDM2. Collectively, cinchonidine exhibited substantial cell-protective effects. It protects HUVECs injury from IS-induced cellular senescence, impairment of vasculogenic activity, and cell death via downregulation of the p53 signaling pathway. Cinchonidine appears to be a potential cytoprotective agent that rescues IS-induced endothelial cell injury.
描述:	博士指導教授:謝政穎共同指導教授:楊志豪委員:謝政穎委員:楊志豪委員:顏茂雄委員:許準榕委員:李燕媚
資料類型:	thesis
顯示於類別:	[醫學科學研究所] 博碩士論文

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